รายงานการศึกษาวิจัยฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาที่สนับสนุนสรรพคุณของตำรับยาห้าราก มีดังนี้

1. ฤทธิ์ลดไข้
   สารสกัดเอทานอลจากตำรับยาห้าราก ขนาด 25-400 มก/กก มีฤทธิ์ลดอุณหภูมิกายของหนูแรท ที่ถูกเหนี่ยวนำให้เป็นไข้ด้วยไลโปโพลีแซคคาไรด์ (lipopolysaccharide; LPS) ขนาด 50 มคก/กก ได้ โดยที่ขนาด 400 มก/กก จะมีประสิทธิภาพสูงสุดในการลดไข้ และที่ขนาด 100 และ 200 มก/กก จะมีประสิทธิ-ภาพในการลดไข้ได้เทียบเท่ากับยาแอสไพริน ขนาด 300 มก/กก (2) ตำรับยาขนาด 100-400 มก./กก. สามารถลดอุณหภูมิกายของหนูแรทที่ถูกเหนี่ยวนำให้เป็นไข้ด้วย Baker’s yeast (ขนาด 0.135 มก./กก.) ได้ โดยที่ขนาด 200 มก/กก จะมีฤทธิ์ดีที่สุด (3)
    
2. ฤทธิ์ต้านการอักเสบ
   สารสกัด 80% เอทานอลจากตำรับยา ความเข้มข้น 1 และ 10 มคก/มล มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยยับยั้งการแสดงออกของโปรตีน cyclooxygenase-2 (COX-2) ในเซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดจากสายรกเด็กแรกคลอด (human umbilical vein endothelial cell) ทึ่ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วย interleukin 1β (IL-1β 1 นาโนกรัม/มล) แต่ไม่มีผลต่อการแสดงออกของ COX-2 mRNA นอกจากนี้สารสกัดที่ความเข้มข้น 1, 10 และ 1000 มคก/มล มีฤทธิ์เพิ่มการผลิต prostaglandin E2 (PGE2) จากกรด arachinodic ที่ให้เข้าไปจากภายนอก แต่สารสกัดที่ความเข้มข้น 100 มคก/มล จะเพิ่มการผลิต PGE2 ได้น้อยกว่าที่ความเข้มข้นต่ำแสดงว่าสารสกัดตำรับยามีผลต่อการทำงานของ COX แบบ biphasic dose-dependent (4) สารสกัด 95% เอทานอลจากตำรับยา มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างไนตริกออกไซด์ (NO) ซึ่งเป็นสารที่ทำให้เกิดการอักเสบ เมื่อทดสอบในเซลล์ macrophage RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS โดยค่าความเข้มข้นของสารสกัดที่มีฤทธิ์ยับยั้งได้ครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 40.4 มคก/มล แต่มีฤทธิ์น้อยกว่ายามาตราฐาน Indomethacin (IC50 เท่ากับ 20.32 มคก/มล) (5)
    
3. ฤทธิ์แก้ปวด
   การทดสอบฤทธิ์แก้ปวดของสารสกัดจากตำรับยาห้าราก ขนาด 25-400 มก/กก ในหนูแรทที่ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดอาการปวดด้วยวิธี hot-plate, tail-flick และ acetic acid-induced writhing (เหนี่ยวนำให้เกิดการปวดจนบิดงอลำตัวด้วยกรดอะซิติก 0.6%) พบว่าสารสกัดจากตำรับยาที่ขนาด 400 มก/กก เท่านั้น มีฤทธิ์แก้ปวดได้ เมื่อทดสอบด้วยวิธ๊ hot-plate แต่ในการทดสอบวิธี tail-flick สารสกัดจากตำรับยาทุกขนาด มีฤทธิ์แก้ปวด ยกเว้นที่ขนาด 25 มก/กก สำหรับการทดสอบวิธี acetic acid-induced writhing พบว่าสารสกัดที่ขนาด 200 และ 400 มก/กก มีฤทธิ์แก้ปวดโดยสามารถลดจำนวนครั้งของการบิดงอลำตัวของหนูได้อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (2)
    
4. ฤทธิ์ต่อการเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือด
   การศึกษาผลต่อการเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือดของตำรับยาห้ารากในอาสามัครสุขภาพดี จำนวน 46 คน อายุ 18-45 ปี โดยให้รับประทานยาห้าราก ขนาด 1,500 มก 3 ครั้ง ทุก 8 ชั่วโมง ทำการเจาะเลือดอาสา- สมัครก่อนได้รับยา และที่เวลา 8, 32 ชม และ 7-10 วัน ภายหลังการให้ยาครั้งแรก วัดผลการเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือดโดยใช้เครื่อง aggregometer และสารกระตุ้นการเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือดที่ใช้ คือ epinephrine, adenosine diphosphate (ADP) และคอลลาเจน พบว่าตำรับยาห้ารากไม่มีผลต่อการเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือดที่ถูกกระตุ้นด้วย epinephrine หรือ ADP ภายในระยะเวลา 1 สัปดาห์หลังรับประทานยา แต่มีผลลดการเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือดที่ถูกกระตุ้นด้วยคอลลาเจนหลังรับประทานยา 32 ชม อาสาสมัครมีอาการไม่พึงประสงค์เล็กน้อย คือ ปวดท้อง และท้องเสีย สรุปว่ายาตำรับห้ารากที่ขนาด 1,500 มก รับประทานทุก 8 ชม. ทั้งหมด 3 ครั้ง มีผลต้านการเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือดที่ถูกกระตุ้นด้วยคอลลาเจน แม้ว่าจะไม่เกิดผลข้างเคียงที่เป็นอันตรายร้ายแรง แต่ควรระมัดระวังความเสี่ยงจากภาวะเลือดออกเมื่อใช้ยานี้อย่างต่อเนื่อง และเป็นระยะเวลานาน (4, 6)
    
5. ฤทธิ์ต้านเชื้อมาลาเรีย
   การศึกษาเปรียบเทียบฤทธิ์ในการต้านเชื้อมาลาเรียสายพันธุ์ที่ไวต่อยาคลอโรควิน (chloroquine-sensitive, Pf3D7) และสายพันธุ์ที่ดื้อต่อยา (chloroquine-resistant, PfW2) ของตำรับยาห้ารากที่เตรียมจากรากหรือเตรียมจากลำต้นรวมทั้งส่วนรากและลำต้นของสมุนไพรเดี่ยวที่เป็นส่วนประกอบของตำรับ พบว่าตำรับยาที่เตรียมจากราก และลำต้น และส่วนของรากและลำต้นในสมุนไพรเดี่ยวๆ สามารถต้านเชื้อมาลาเรีย มีความเป็นพิษต่ำ และความจำเพาะต่อฤทธิ์ต้านเชื้อมาลาเรีย โดยมีค่า SI values (selective index = TC50cytotoxicity/IC50 antiplasmodial activity) อยู่ในช่วง 3.55 -19.74 สารสกัดจากตำรับยาห้ารากสามารถต้านเชื้อมาลาเรียสายพันธุ์ Pf3D7 และสายพันธ์ PfW2 โดยมีค่า IC50 < 5 และ 6-10 มคก/มล ตามลำดับ ในขณะที่รากและลำต้นของสมุนไพรเดี่ยวทั้ง 5 ต้น พบว่าย่านางมีประสิทธิภาพสูงสุด IC50 < 5 มคก/มล) และมีความจำเพาะต่อฤทธิ์ต้านเชื้อมาลาเรีย > 10 และสามารถแยกสารสำคัญที่ออกฤทธิ์ คือ tiliacorinine และ yanangcorinine จากสารสกัดลำต้นย่านาง โดยตรวจพบปริมาณสารทั้งสองชนิดในตำรับยาห้ารากอยู่ถึง 0.57-7.66% นอกจากนี้เมื่อดูความสัมพันธ์ระหว่างค่า IC50 และปริมาณสารทั้งสองชนิดในตำรับ พบว่าตำรับยาห้ารากมีประสิทธิภาพในการต้านเชื้อมาลาเรียสูงกว่าสารเดี่ยวๆ แสดงให้เห็นว่าเมื่อนำมาทำเป็นตำรับจะมีการเสริมฤทธิ์กันทำให้มีฤทธิ์ต้านมาลาเรียสูงมากขึ้น และลดความเป็นพิษของสมุนไพรในแต่ละต้นลง สรุปได้ว่าตำรับยาที่เตรียมจากราก หรือลำต้น มีประสิทธิภาพในการต้านเชื้อมาลาเรียได้ใกล้เคียงกัน จึงสามารถใช้ส่วนลำต้นทดแทนรากได้ เพื่อลดความเสี่ยงต่อการสูญพันธุ์ของพืช (7)
    
6. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ
   สารสกัดเอทานอล (8) และสารสกัด 95% เอทานอลจากตำรับยา (5) มีฤทธิ์ปานกลางในการต้านอนุมูลอิสระ เมื่อทดสอบด้วยวิธี DPPH สารสกัด 80% เอทานอลจากตำรับยา ความเข้มข้น 15-30 มคก/มล มีผลป้องกันการลดลงของปริมาณของ glutathione และการทำงานของเอนไซม์ catalase, glutathione peroxidase และ glutathione S-transferase ในเซลล์ B16F10F10 melanoma ที่ถูกกระตุ้นด้วยรังสียูวีเอได้ (4)
    
7. ฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย
   การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่ก่อให้เกิดสิวและหนอง ได้แก่ Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis และ Staphylococcus aureus ของสารสกัด 95% เอทานอลจากตำรับยาห้ารากและรากสมุนไพรเดี่ยวทั้ง 5 ชนิดในตำรับ (9, 10) เปลือกมังคุด และเปลือกมังคุดผสมตำรับยาห้าราก (9) พบว่าสารสกัดทุกชนิดยกเว้นสารสกัดจากรากชิงชี่ มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ P. acnes และสารสกัดจากตำรับยาห้าราก รากคนทา เปลือกมังคุด และเปลือกมังคุดผสมตำรับยาห้าราก มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ S. aureus และ S. epidermidis ได้ จากผลการวิจัยสามารถสนับสนุนการใช้ตำรับยาห้ารากในการรักษาสิวและนำไปพัฒนาต่อยอดเป็นผลิตภัณฑ์เพื่อแก้ปัญหาสิวต่อไป
   
   การศึกษาฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียของสารสกัด 95% เอทานอลและสารสกัดน้ำจากตำรับยาห้ารากและรากสมุนไพรเดี่ยวทั้ง 5 ชนิดในตำรับ พบว่าสารสกัด 95% เอทานอลจากตำรับ มีฤทธิ์ต้านเชื้อ S. aureus, Streptococcus pyrogenes, Shigella boydii, S. dysenteriae, S. flexneri, Acinetobacter buamannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae และ Bacillus subtilis ขณะที่สารสกัดน้ำไม่มีผล ส่วนสารสกัด 95% เอทานอลจากรากย่านาง รากเท้ายายม่อม และสารสกัดน้ำจากรากชิงชี่ จะมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียได้ครอบคลุมมากที่สุด (11)
    
8. ฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานินและเอนไซม์ไทโรซิเนส
   สารสกัด 80% เอทานอลจากตำรับยา ความเข้มข้น 15-30 มคก/มล มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสี เมลานินและยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสในเซลล์ B16F10F10 melanoma ที่ถูกกระตุ้นด้วยรังสียูวีเอ (4)
    
9. ฤทธิ์ต้านการแพ้
   การศึกษาฤทธิ์ต้านการแพ้ของสารสกัด 95% เอทานอลจากตำรับยาห้ารากและสมุนไพรเดี่ยวที่เป็นส่วนประกอบของตำรับ โดยวิธีการวัดค่าการยับยั้งการหลั่งเอนไซม์ β-hexosaminidase จากเซลล์เม็ดเลือดขาวของหนู (RBL-2H3) พบว่าสารสกัดจากรากคนทามีฤทธิ์ต้านการแพ้ดีที่สุด รองลงมาคือ สารสกัดจากรากมะเดื่ออุทุมพร และตำรับยาห้าราก (ค่า IC50 = 14.5, 27.7 และ 39.8 มคก/มล ตามลำดับ) นอกจากนี้ยังพบว่าสารสำคัญที่แยกได้จากตำรับยา ได้แก่ pectolinarigenin และ O-methylalloptaeroxylin มีฤทธิ์ในการต้านการแพ้ได้ดีกว่าสารสกัดจากตำรับยา (ค่า IC50 = 6.3 และ 14.16 มคก/มล ตามลำดับ) และมีฤทธิ์ดีกว่ายา chlorpheniramine (IC50 =16.2 มคก/มล) (12)
    

หลักฐานความเป็นพิษและการทดสอบความเป็นพิษ

• การทดสอบความเป็นพิษ
  
  เมื่อให้สารสกัด 80% เอทานอลจากตำรับยาห้าราก ขนาด 300, 1000, 3000 มก/กก แก่หนูแรท เป็นเวลา 14 วัน ไม่พบความเป็นพิษต่ออวัยวะของหนู (4)
  
  พิษต่อเซลล์
  
  สารสกัดเอทานอลจากตำรับยา สารสกัดน้ำและสารสกัดเอทานอลจากรากย่านาง และรากคนทา เป็นพิษต่อเซลล์ไรทะเล เมื่อทดสอบด้วยวิธี Artemia salina lethality assay โดยมีค่าความเข้มข้นที่ทำให้ไรทะเลตายครึ่งหนึ่ง (LC50) เท่ากับ 265, 44 และ 600 มคก/มล ตามลำดับ ส่วนสมุนไพรเดี่ยวอื่นๆ ในตำรับไม่เป็นพิษต่อเซลล์ (8)
• ฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์
  
  สารสกัดเอทานอลจากตำรับยาห้าราก สารสกัดน้ำและสารสกัดเอทานอลจากสมุนไพรเดี่ยวในตำรับความเข้มข้น 5, 10, 20 และ 40 มก/จานเพาะเชื้อ ไม่มีฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์โดยตรงเมื่อทดสอบในเชื้อ Salmonella typhimurium TA98 และ TA100 แต่มีฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ทางอ้อมหลังจากทำปฏิกิริยากับไนไตรท์ (nitrosation) อย่างไรก็ตามพบว่าสารสกัดจากตำรับยาห้าราก และสารสกัดจากสมุนไพรเดี่ยวแต่ละชนิด มีฤทธิ์ต้านการก่อกลายพันธุ์ของสารก่อกลายพันธุ์จากปฏิกิริยาของไนไตรท์กับวันอะมิโนไพรีน (nitrite treated 1-aminopyrene) ในเชื้อ Salmonella typhimurium ทั้ง 2 สายพันธุ์ได้ (8)
• ทำให้เกิดการแพ้ การระคายเคืองต่อผิว
  
  การศึกษาเรื่องความปลอดภัยของสารสกัด 95% เอทานอลจากตำรับยาห้ารากและสมุนไพรเดี่ยวที่เป็นส่วนประกอบของตำรับ ความเข้มข้น 10% และ 20% โดยทดสอบการก่อการแพ้แบบปฎิกิริยาอิมมูนและการก่อการระคายเคืองต่อผิวหนังของอาสาสมัครสุขภาพดี จำนวน 10 คน อายุระหว่าง 21-28 ปี ด้วยวิธีการปิดสารทดสอบบนผิวหนัง (closed patch test under occlusion) บริเวณแผ่นหลังส่วนบนข้างแนวกระดูกสันหลังระหว่างสะบักของอาสาสมัคร ทำการอ่านผลเมื่อครบ 48 และ 96 ชม. พบว่าสารสกัดจากตำรับยาห้ารากไม่ทำให้เกิดระคายเคืองและการแพ้แบบปฎิกิริยาอิมมูนต่อผิวหนังคน จึงน่าจะมีความปลอดภัยสูงในการที่จะนำไปพัฒนาเป็นยาหรือผลิตภัณฑ์สำหรับใช้ภายนอกกับผิวหนัง ขณะที่รากคนทาและรากชิงชี่มีโอกาสทำให้เกิดการแพ้แบบปฎิกิริยาอิมมูน จึงไม่เหมาะสม สำหรับสมุนไพรเดี่ยวอิ่นๆ ในตำรับ ให้ผลไม่ชัดเจน ดังนั้นจึงควรมีการศึกษาเพิ่มเติม (13)
  
             จากข้อมูลรายงานการศึกษาวิจัยของตำรับยาห้าราก จะเห็นว่ามีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาต่างๆ ที่ใช้เป็นหลักฐานทางวิทยาศาสตร์เพื่อสนับสนุนสรรพคุณของตำรับยา ช่วยทำให้เกิดความเข้าใจด้านความปลอดภัย ประสิทธิภาพ และคุณภาพของสมุนไพรแต่ชนิดและตำรับยาห้ารากในการที่จะนำมาใช้รักษาอาการไข้ได้เช่นเดียวกับยาแผนปัจจุบัน หรือนำไปพัฒนาใช้สำหรับรักษาโรคอื่นๆ ซึ่งจะเป็นการสนับสนุนและเผยแพร่การใช้ตำรับยาที่มีการใช้ตามองค์ความรู้ดั้งเดิมให้เป็นที่ยอมรับของบุคลากรทางการแพทย์และประชาชนต่อไป
  
  เอกสารอ้างอิง

1. ประกาศคณะกรรมการพัฒนาระบบยาแห่งชาติ เรื่อง บัญชียาหลักแห่งชาติ (ฉบับที่ 2) พ.ศ. 2555 ประกาศ ณ วันที่ 21 สิงหาคม พ.ศ. 2555 คัดจากราชกิจจานุเบกษา เล่ม 130 ตอนพิเศษ 9 ง วันที่ 23 มกราคม 2556.
2. Jongchanapong A, Singharachai C, Palanuvej C, Ruangrungsi N, Towiwat P. Antipyretic and antinociceptive effects of Ben-cha-lo-ka-wi-chian remedy. J Health Res 2010;24(1): 15-22.
3. อำภา คนซื่อ ชยันต์ พิเชียรสุนทร จินตนา สัตยาศัย ประภาวดี พัวไพโรจน์ ศุภชัย ติยวรนันท์. การศึกษาฤทธิ์ลดไข้ของยาเบญจโลกวิเชียรในสัตว์ทดลอง. วารสารการแพทย์แผนไทยและการแพทย์ทางเลือก 2551;6(2):42.
4. พินภัทร ไตรภัทร ประวิทย์ อัครเสรีนนท์ อุไรวรรณ พานิช วีรดี จันทรนิภาพงศ์. รายงานวิจัยเรื่องการศึกษาฤทธิ์ของสมุนไพรตำรับห้ารากอายุรเวทศิริราชในการต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต้านเกล็ดเลือด. กรุงเทพ: สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2556.
5. Juckmeta T, Itharat A. Anti- inflammatory and antioxidant activities of Thai traditional remedy called “Ya-ha- rak”. J Health Res 2012;26(4): 205-10.
6. Chandranipapongse W, Palo T, Chotewuttakorn S, Tripatara P, Booranasubkajorn S, Laohapand T, Akarasereenont P. Study the effect of an antipyretic drug, Thai herbal Ha-rak formula on platelet aggregation in healthy Thai volunteers: a randomized, placebo-controlled trial. SMJ 2017;69(5):283-9.
7. Nutmakul T, Pattanapanyasat K, Soonthornchareonnon N, Shiomi K, Mori M, Prathanturarug S. Antiplasmodial activities of a Thai traditional antipyretic formulation, Bencha-Loga-Wichian: A comparative study between the roots and their substitutes, the stems. J Ethnopharmacol 2016;193:125-32.
8. Singharachai C, Palanuvej C, Kiyohara H. Yamada H, Ruangrungsi N. Safety evaluation of Thai traditional medicine remedy: Ben-cha-lo-ka-wi-chian. J Health Res 2011;25(2):83-90.
9. สุมนา จินดาพงษ์ สุมาลี ปานทอง อินทิช ศักดิ์ภักดิเจริญ อรุณพร อิฐรัตน์. การพัฒนาเจลแต้มสิวจากสารสกัดเปลือกมังคุดและตำรับเบญจโลกวิเชียร. วารสารการแพทย์แผนไทยและการแพทย์ทางเลือก 2010; 8(2):29.
10. สุมนา จินดาพงษ์ สุมาลี ปานทอง อรุณพร อิฐรัตน์. การศึกษาฤทธิ์การต้านจุลชีพที่ก่อให้เกิดสิวของสารสกัดสมุนไพรในตำรับเบญจโลกวิเชียร. การประชุมเครือข่ายวิชาการบัณทิตศึกษาแห่งชาติครั้งที่ 1, 18 ธันวาคม 2555; มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ จ. ปทุมธานี.
11. Nuaeissara S, Kondo S, Itharat A. Antimicrobial activity of the extracts from Benchalokawichian remedy and its components. J Med Assoc Thai 2011;94(Suppl.7): S172-S177.
12. Juckmeta T, Thongdeeying P, Itharat A. Inhibitory effect on ?-hexosaminidase release from RBL-2H3 cells of extracts and some pure constituents of benchalokawichian, a Thai herbal remedy, used for allergic disorders. Evid Based Complement Alternat Med 2014; 1-8.
13. วรัมพา สุวรรณรัตน์ มะลิ อาจริยะกุล อรุณพร อิฐรัตน์ สมบูรณ์ เกียรตินันทน์. การศึกษาทางคลินิกระยะที่ ๑ เรื่องความปลอดภัยของสารสกัดตำรับยาเบญจโลกวิเชียร (ห้าราก) และสารสกัดสมุนไพรเดี่ยวที่เป็นส่วนประกอบของตำรับ. ธรรมศาสตร์เวชสาร 2555;12(4):767-76.